Вмороженном хрене сохраняется птроксидаза
Биология — Пероксидаза хрена
Пероксидаза хрена фермент, выделенный из хрена, широко применяющийся в молекулярно-биологических методиках для усиления слабого сигнала до уровня, необходимого для детекции. Пероксидаза хрена имеет молекулярную массу около 44,173.9 Да, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить.
Продукт активности пероксидазы хрена представляет собой цветное или люминесцентное соединение, подходящее для детекции и количественного анализа. HRP часто используют в составе конъюгатов для детекции определенных молекул. Например, в случае вестерн блоттинга используют конъюгаты HRP с антителами против заданных белков или молекул; в данном случае антитело обладает специфичностью к заданной мишени, а HRP образует детектируемый сигнал.. Пероксидазу хрена также используют в таких методиках, как ИФА и для иммуногистохимического анализа.
Пероксидаза хрена представляет собой идеальный фермент для многих методик, так как имеет относительно небольшой размер, относительно стабильна и более дешева, чем альтернативы — например, щелочная фосфатаза. HRP имеет большее количество оборотов в единицу времени и потому обеспечивает развитие достаточно сильного сигнала за относительно небольшой период времени.
Пероксидаза хрена фермент, выделенный из хрена, широко применяющийся в молекулярно-биологических методиках для усиления слабого сигнала до уровня, необходимого для детекции. Пероксидаза хрена имеет молекулярную массу около 44,173.9 Да, представляет собой гликопротеид и имеет четыре остатка аминокислоты лизина для соединения с молекулой, которую требуется пометить.
Пероксидаза — хрен
Пероксидаза хрена в действительности не является простым ферментом. По-видимому, у многих, если не у всех, высших растений имеется множество форм пероксидазы ( иногда их называют изоферментами) которые удается разделить методами электрофореза и ( или) хроматографии. Множественность форм пероксидазы можно сопоставить с неоднородностью, обнаруженной у гемогло-бинов ( разд. Подобные колебания в относительной концентрации изоферментов, возможно, связаны с различными и изменяющимися функциями пероксидаз в метаболизме растений. Природа неоднородности остается неясной. [1]
Пероксидаза хрена имеет молекулярный вес около 40 000, из которого 16 % приходится на углевод, и содержит один атом железа. Цитрохром с-пероксидаза имеет молекулярный вес 34 000 и содержит также один атом железа, но не содержит углевода. Этот фермент образован четырьмя субъединицами, каждая из которых содержит по одному атому железа. Проведены исследования механизма реакций при участии как бактериальных каталаз, так и каталаз млекопитающих. Все они проявляют сходную активность. [2]
А с пероксидазой хрена , количество которой определяется по окрашиванию, возникающему при добавлении смеси 4-аминоантипирина и фенола. Этот анализ является типичным примером использования конструкции сэндвича, которая в этом случае состоит из антигена, специфического антитела и вспомогательного белка А, несущего метку. Меченый компонент, предназначенный для иммунохимического анализа, можно также использовать в конкурентном варианте. [3]
Каталаза обнаруживает поразительное сходство с пероксидазой хрена в реакции восстановления ее нитритом, зависящей от присоединения протона. [4]
Окисление восстановленного пиридиндинуклеотида ( NADH), катализируемое пероксидазой хрена . [5]
Кентен и Манн ( 1949) показали, что пероксидаза хрена и других растений может катализировать окисление Мп до Мп в присутствии Н2О2 в результате циклической окислительно-восстановительной реакции. [6]
СУ — щественно не меняются в результате влияния белка в пероксидазе хрена ( и, вероятно, в других гемопротеинах, например в миогло-бине), однако белок в каталазе может существенно понизить скорость этих реакций за счет пространственных затруднений ( в 103 — 108 раз), если молекулы восстановителя достаточно велики. [7]
Среди них были желудочная и панкреатическая липазы, — глюкозидаза, са-хараза, инвертаза, панкреатическая амилаза, пероксидаза хрена и другие. [8]
Именно к биохимическому анализу в настоящее время проявлен наибольший интерес и получены результаты, которые продвинули проточные методы в биохимию, медицину, фармацевтику и другие области, в которых они ранее не применялись. Так, для амперометрического детектирования глюкозы, этанола и аминокислот в ПИА используются электроды с иммобилизованными глюкозоксидазой, пероксидазой хрена , алко-гольоксидазой и др. Однако требования к работе таких электродов выше, чем при обычных измерениях. [10]
Этот фермент похож на другие пероксидазы при использовании таких субстратов, как гваякол, пирогаллол и аскорбиновая кислота, хотя активность хлоропероксидазы в отношении первого из этих субстратов в 10 раз ниже, чем пероксидазы хрена. Хлоропероксидаза похожа на каталазу в том отношении, что она тоже катализирует выделение кислорода из перекиси водорода, хотя и менее эффективно, чем каталаза ( активность около 2 / 6 активности каталазы при рН 4 5), а также в том, что она катализирует окисление этанола перекисью водорода в уксусный альдегид и, вероятно, в муравьиную кислоту. Таким образом, Хлоропероксидаза по своим каталитическим свойствам находится между каталазами и типичными перок-сидазами. Она несколько менее активна, чем пероксидаза хрена , при окислении таких субстратов, как гваякол, и несколько менее активна, чем каталаза, при разложении перекиси водорода. Кроме того, она катализирует реакции хлорирования, на которые каталаза и пероксидаза не влияют. [11]
С целью получения моноспецифической сыворотки проведена иммунизация животных полученными субстанциями. Для получения антител против морфина в течение 3 — х месяцев проводили гипериммунизацию 6 кроликов конъюги-рованным антигеном морфин — бычий сывороточный альбумин. Для этого на полистирольные планшеты сорбировали конъюгат морфин-альбумин, а количество связавшихся с ним антиморфиновых антител контролировали с помощью анти-видовых антител к иммуноглобулинам кролика, ковалентно связанных с пероксидазой хрена . Из этих антисывороток была наработана гамма-глобулиновая фракция антиморфиновых антител в количестве 20 мг. [12]
Кентен и Манн ( 1949) показали, что пероксидаза хрена и других растений может катализировать окисление Мп до Мп в присутствии Н2О2 в результате циклической окислительно-восстановительной реакции. [6]
1 Пероксидаза из корней хрена: модулирование Успехи биологической свойств химии, т. 51, 2011, с ПЕРОКСИДАЗА ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА: МОДУЛИРОВАНИЕ СВОЙСТВ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИЕЙ БЕЛКОВОЙ ГЛОБУЛЫ И ГЕМА г. Г. С. ЗАХАРОВА 1,3, И. В. УПОРОВ 2, В. И. ТИШКОВ 1,2,3* 1 Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, Москва 2 Московский государственный университет им. М.В.Ломоносова, Москва 3 ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», Москва I. Введение. II. Краткая характеристика пероксидазы хрена. III. Иссле дование пероксидазы с помощью мутагенеза. IV. Химическая модификация белковой глобулы. V. Химическая модифи кация простетической группы. VI. Моделирование структуры HRP с модифицированными производными гема. VII. Заключение. I. ВВЕДЕНИЕ Пероксидазы (КФ Х) относятся к ферментам класса оксидоредуктаз. Они катализируют окисление широкого спектра субстратов под действием пероксида водорода. Молекулярная масса ферментов этого типа колеблется от 17 до 84 кда, а длина полипептидной цепи от 153 до 753 аминокислотных остатков. Белковая глобула обычно обра зована α-спиралями, β-складки либо отсутствуют, либо пред ставлены слабо. В большинстве случаев в молекуле различают два структурных домена, между которыми в гидрофобном кармане рас по ложена простетическая группа гем (комплекс железа с протопор фирином IX (рис. 1) [1]. Принятые сокращения: HRP изофермент С пероксидазы из корней хрена; n-hrp нативная HRP; rs-hrp реконструированный фермент; БФСА бифункциональные сшивающие агенты; ФГ фенилгидразин; ФЭГ фенилэтил гидразин; ЭГ этилгидразин; МГ метилгидразин; ППДР площадь поверх ности, доступная для растворителя; СПГ синтетические производные гема; АБТС 2,2-азино-диэтилбензтиазолинсульфонат. *Адрес для корреспонденции: Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ а.
2 38 Г.С.Захарова и соавт. Рис.1. Подпись см. на сл. стр.
3 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 39 Рис. 1. Структура гема и продуктов его химической модификации. Соединения 1 4 образовывались в результате каталитического окисления раз лич ных субстратов: 1 фенилгидразина [87]; 2а — фенилэтилгидразина, 2б этил гид разина, 2в метилгидразина [88]; 3 азида натрия [89]; 4 цианида калия [90]. Соединения 5а и 5б в результате инкубации в ацетатном буфере (рн = 4,4) или с другими кислотами (н-гексановой и фенилуксусной, при аналогичном значе нии рн) [91]. Соединения 6 9 произ водные протопорфирина, полученные путём химического синтеза [97, 98, 101, 102]. Согласно общепринятой классификации, предложенной в 1992 г. [2], пероксидазы подразделяются на два больших суперсемейства: животные пероксидазы и растительные. Суперсемейство растительных пероксидаз в свою очередь включает в себя 3 класса. Эта классифи ка ция изначально основывалась на сопоставлении аминокислотных последовательностей ферментов, полученные впоследствии данные рентгеноструктурного анализа для представителей разных классов пероксидаз подтвердили правильность подобного деления. Первый класс растительных пероксидаз включает внутриклеточные ферменты, такие как аскорбатпероксидаза, дрожжевая цитохром с пероксидаза и бактериальная каталаза-пероксидаза. Эти белки не гли ко зилированы и не содержат ни дисульфидных связей, ни ионов кальция. Ко второму классу относятся секретируемые грибные пероксидазы. Наиболее хорошо изученные представители этого класса лигнинпероксидаза и марганецпероксидаза, принимающие участие в окислении лигнина, а также пероксидаза из Coprinus cine reus (навозник обыкновенный, предыдущее название Arthromyces ramosus). Эти ферменты являются мономерными гликопротеидами, для которых характерно наличие четырёх дисульфидных связей и двух консервативных кальций-связывающих доменов. Третий класс представлен секретируемыми пероксидазами растений. Эти ферменты также являются мономерными гликопротеидами, имеют четыре дисуль фидные связи и два кальций-связывающих центра, однако распо ложение дисульфидных связей и «укладка» полипептидной цепи в пероксидазах второго и третьего классов несколько различаются. Изофермент С пероксидазы из корней хрена хрена (HRP hor seradish peroxidase) является безусловным лидером по популяр ности среди растительных пероксидаз. В настоящее время он рас сматривается как модельный для третьего класса растительных перокси даз. Несмотря на то, что по многим параметрам HRP уступает другим известным пероксидазам, этот фермент наиболее широко используется на практике. Накопленные за десятилетия данные позволили эффективно использовать этот фермент при создании имму нологических тестов [3, 4], различных биосенсоров [5 7], мар-
4 40 Г.С.Захарова и соавт. ке ров для гистологических исследований [8], использовать в генной терапии [9, 10] и органическом синтезе [11, 12]. Исследования механизма действия HRP с целью улучшения или изме нения её свойств активно ведутся и в настоящее время, при этом в основном используется метод направленного мутагенеза. В представленном обзоре будут рассмотрены и проанализированы данные, полученные с исполь зо ванием другого подхода химической модификации как ами но кис лотных остатков фермента, так и порфиринового кольца гема. II. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЕРОКСИДАЗЫ ХРЕНА В корнях хрена (Armoracia rusticana) содержится множество различных пероксидаз, но основная доля приходится на изофермент С, харак те ризующийся изоэлектрической точкой pi = 9 и проявляющий макси мальную активность при рн = 6 8. Молекулярная масса HRP сос тавляет около 44 кда, 18 22% приходится на углеводную часть. Из девяти остатков Asn, по которым возможно при сое динение углеводных цепей, как правило, гликозилированы восемь остатков (Asn 13, 57, 158, 186, 198, 214, 255 и 268) [13]. Сос тав угле водной части моле кулы гетерогенен и зависит от многих факто ров, напри мер, от ста дии и условий роста. Олигосахариды оказывают стаби лизирующее воздей ст вие на фермент. Они защищают фермент от протеолиза и моди фи кации полипептидной цепи под действием сво бод ных радика лов, образующихся в ходе реакции [14 17]. На протяжении длительного времени третичная структура HRP была неизвестна. Установить её стало возможно только после получе ния рекомбинантного фермента [18], так как все попытки кристаллизации нативной HRP из-за гетерогенности гликозилирования не увенчались успехом. Рекомбинантный негликозилированный фермент был получен в результате экспрессии в клетках E.coli синтетического гена, HRP, синтезированного по аминокислотной последовательности, установленной Карин Велиндер [19]. В настоящее время установлена трехмерная структура еще шести других растительных пероксидаз из арахиса [20], ячменя [21], Arabiropsis thaliana [22], сои [23], табака (И.Г.Газарян, персональное сообщение) и королевской пальмы [24]. Данные рентгеноструктурного анализа HRP показали, что полипеп тидная цепь, состоящая из 308 аминокислотных остатков, обра зует 13 α-спиралей и 3 β-складки [25]. Правильная конформация моле кулы поддерживается четырьмя дисульфидными связями (между остатками Cys 11 91, 44 49, и ). В структуре белковой
5 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 41 глобулы имеются два домена дистальный и проксимальный. Каждый из них содержит сайт связывания кальция, в которых катионы кальция удерживаются семью координационными связями. Важ ная структурная роль Ca 2+ подтверждена многочисленными экспе римен тальными данными [26 32] и результатами компьютерного моде лирования [33]. Так как центры связывания катионов кальция соединены системой водородных связей с активным центром фермента, удаление Ca 2+ влечёт за собой серьёзные изменения в свойст вах фермента [31]. Дистальный катион связан менее прочно, чем прокси мальный [1]. Его удаление приводит к падению каталитической актив ности приблизительно в 2 раза и снижению термостабильности фермента, а также стабильности при экстремальных значениях рн и при хранении. Третичная структура молекулы при удалении дистального Ca 2+ претерпевает малые изменения [28]. Полная потеря катионов кальция приводит к инактивация фермента вследствие серьезных конформационных изменений в активном центре [29 31]. В активном центре фермента расположена простетическая группа гем (комплекс трехвалентного железа с протопорфирином IX, рис. 1). Ион Fe 3+ имеет 4 координационные связи внутри гема, пятое координационное положение занимает атом азота имидазольного кольца проксимального остатка His170. Шестое координационное поло жение в релаксированном состоянии фермента свободно, но в процессе катализа происходит присоединение пероксида водорода к атому железа, и комплекс становится шестикоординационным [34]. Пероксидаза хрена способна окислять большой спектр субстратов, однако типичными субстратами являются фенолы, индолы, аро матические амины и сульфонаты. В процессе окисления ароматических субстратов происходит их полимеризация, что можно использовать, в частности, для очистки воды от загрязнений подобными соединениями [35, 36]. Каталитический цикл HRP включает следующие стадии: HRP + H 2 O 2 Соединение I + H 2 O (1) Соединение I + AH 2 Соединение II + AH (2) Соединение II + AH 2 HRP + AH, (3) где AH 2 электрон-донорный субстрат, AH радикальный продукт реакции. На первой стадии в результате взаимодействия HRP с пероксидом водорода от молекулы фермента отщепляются два электрона (один от атома железа и один из порфиринового кольца). В результате обра-
6 42 Г.С.Захарова и соавт. зуется катион-радикал, который получил название Соединения I. Его восстановление донором электронов до исходного ферри-фермента протекает в две стадии через образование Соединения II. Таким образом, превращение субстрата протекает по механизму пинг-понг (Соединение I реагирует с первой молекулой субстрата с образованием Соединения II, которое в свою очередь взаимодействует со второй молекулой субстрата). Более подробно механизм катализа рассмотрен в обзорах [15, 37 39]. III. ИССЛЕДОВАНИЕ ПЕРОКСИДАЗЫ С ПОМОЩЬЮ МУТАГЕНЕЗА Этот высокоэффективный метод позволяет выявить аминокислотные остатки, играющие ключевую роль в катализе, поддержании структуры и стабильности фермента. С его помощью удаётся получить фер менты с повышенной стабильностью [40, 41], изменённой субстратной специфичностью [42]. Результаты таких исследований активно используются на практике для получения ферментов с задан ными свойствами. В нашей лаборатории таким образом были полу чены биокатализаторы с уникальными свойствами на основе фор миатдегидрогеназы и оксидазы D-аминокислот [43 47]. Для введения аминокислотных замен в молекулу фермента можно использовать методы неупорядоченного (направленная эволюция, генная мозайка и др.) и направленного мутагенеза. Последний подход часто называют рациональным дизайном, поскольку точечное введение замен выполняют на основе анализа аминокислотных после довательностей или структуры фермента. В случае пероксидазы в основном используется рациональный дизайн. Это связано с тем, что в клетках E.coli HRP экспрессируется в нерастворимой форме и для получения активного фермента проводится рефолдинг из телец вклю чения [18]. В лаборатории Ф.Арнольд были предприняты попытки с помощью направленной эволюции ввести в молекулу HRP точечные замены, которые позволили бы экспрессировать активный рекомбинантный фермент в клетках E.coli [48] и в метилотрофных [49] и пекарских [50] дрожжах. Однако в случае E.coli эксперименты были неудачными, а в дрожжах происходило гипергликозилирование молекулярная масса углеводной части достигала до 60 кда, в то время как в природном фермента она равна всего 10 кда. Направленный мутагенез HRP был использован для выяснения роли аминокислотных остатков в связывании гема в дистальной области активного центра, изучения механизма взаимодействия с
7 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 43 Н 2 О 2 и каталитического окисления субстрата, поиска потенциальных сайтов связывания различных типов субстратов, а также для оценки роли катионов кальция в фолдинге и каталитическом действии HRP. При ведём основные выводы этих экспериментов: 1) дистальные остатки His42 и Arg38 играют основную роль в свя зывании молекулы Н 2 О 2 и гетеролитическом расщеплении связи О-О [51 53]; 2) остаток Phe41 участвует в координации гема, в контролировании доступа к феррильному кислороду в Соединении I, влияет на суб стратную специфичность [51, 54 57]; 3) водородные связи между остатками His42, Asn70 и Glu64 соединяют дистальный кальций-связывающий участок и активный центр фермента. По-видимому, это необходимо для обеспечения правильной ориентации имидазольного кольца His42 по отношению к порфирину [58 60]; 4) прочность связывания гема в активном центре обеспечивается наличием координационной связи между железом гема и прокси мальным остатком His170 [61]; 5) роль остатка Asp247, возможно, состоит в усилении основ ности His170, что позволяет поддерживать комплекс железа в пяти коор дина ционном состоянии [25]; 6) остатки Phe179 и Phe142 играют ключевую роль в связывании ароматических субстратов [62 64]; 7) остаток Trp117 участвует в миграции энергии внутри молекулы и влияет на фолдинг фермента и его стабильность [65, 66]; 8) остаток Thr171 важен для поддержания правильной конформа ции фермента, т.к. он соединяет гем с проксимальным кальцийсвязывающим центром [67]; 9) неструктурированные участки полипептидной цепи играют важную роль в стабильности фермента. Аминокислотные замены в этих участках (Thr102Ala, Gln106Arg, Gln107Asp, Thr110Val, Ile180Phe) снижали температурную стабильность фермента [68]; 10) замена в рекомбинантном белке остатков Asn13 и Asn268 (которые в нативной HRP гликозилированы) на остатки Asp приводит к увеличению термостабильности и устойчивости к инактивации перок сидом водорода [17]. С подробным описанием введенных точечных мутаций и результатов, к которым приводили замены аминокислотных остатков, можно ознакомиться в обзорах [15, 37 39]. Таким образом, методы генной инженерии предоставляют широкие возможности исследователю в получении фермента с новыми
8 44 Г.С.Захарова и соавт. свойствами, однако влиять на характеристики фермента можно не только путем введения мутаций в белок. Не менее эффективным средст вом служит введение химических модификаций. Пример подоб ного подхода модификация экспонированных в раствор амино кислотных остатков. IV. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ БЕЛКОВОЙ ГЛОБУЛЫ Эксперименты по химической модификации проводили как с натив ной пероксидазой хрена (n-hrp), имеющей олигосахаридную часть, так и с рекомбинантным негликозилированным ферментом. В большинстве случае использовали n-hrp, поскольку в этом случае сохраняется возможность её иммобилизации и конъюгирования с дру гими белками (в частности, антителами) её углеводной части. Кроме того, гликозилированный фермент более стабилен и доступен. Химическая модификация остатков His [69 71], Tyr, Arg, Asp и Glu [72] или не влияет на свойства фермента, или приводит к их ухудше нию. Оказалось, что из 3 остатков His (40, 42 и 170) для модификации доступны только два, так как His170 участвует в координации гема [71]. Модификация остатка His42 приводит к потере активности фер мента, однако при этом такой фермент сохраняет способность связы вать ароматические субстраты и образовывать Соединение I [70, 71]. Эти результаты служат подтверждением ключевой роли остатка His42 в процессе переноса энергии от субстрата к простетической группе. Положительные результаты были получены только после модификации остатков лизина. Поэтому именно они и выступали чаще всего в качестве мишени [73 84]. Шесть остатков лизина в молекуле HRP (Lys 65, 84, 149, 174, 232 и 241 [19]) в разной степени подвержены моди фикации. Показано, что наиболее реакционно способен остаток Lys232, в меньшей степени Lys241 и Lys174, а остатки Lys65, 84 и 149 практически не модифицируются [77]. Эти данные хорошо согласуют с результатами других работ, в которых было установлено, что на 1 молекулу пероксидазы приходится 3 модифицированных остатка Lys [75, 77, 78, 80 84]. Для модификации остатков Lys использовали как би-, так и монофункциональные реагенты (см. табл. 1). Исследования показали, что взаимодействие с бифункциональными сшивающими агентами (БФСА) оказывало стабилизирующий эффект. Например, скорость инактивации EG-NHS-HRP (здесь и далее первая часть сокращённого наз вания фермента относится к названию модифицирующего агента в
9 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 45 EG-NHS SA-NHS Таблица 1 Химическая модификация остатков лизина в пероксидазе хрена* Термостабиль ность Активность в органических растворителях Каталитическая активность Ссылка Реагент Lys t, o C растворитель t, o C S метанол 25
Продолжение табл. 1 см. на сл. стр.
10 46 Г.С.Захарова и соавт. AA-NHS PA TMA Продолжение табл метанол ДМФА ТГФ 25
[78 80] Ф + ДМФА 30 + АФ + ТГФ АЦН 60 + МФ НФ
н.д. н.д. н.д. ТМБ [79] Продолжение табл. 1 см. на сл. стр.
11 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 47 PMA GA CA Продолжение табл
н.д. н.д. н.д. ТМБ [79] н.д. н.д. н.д. Ф + [78] ДМФА 25 + Ф
[82, 83] 70 + ТГФ 25 + ДМСО 25 + Окончание табл. 1 см. на сл. стр.
12 48 Г.С.Захарова и соавт. Окончание табл ДМФА 25 + н.д. н.д. [82] ТГФ 25 + MA ДМСО
н.д. н.д. н.д. Ф + [81, 84] 75 + AQ * Обозначения: эффект (изменение свойства по сравнению с немодифицированным ферментом); S субстрат; EG-NHS эти ленгликольбис-(n-гидрокси сукцин имидил сукцинат); SA-NHS субериновой кислоты бис-(n-гидроксисукцинимидный эфир); AA-NHS уксусной кислоты N-гидроксисукцинимидный эфир; PA фталевый ангидрид; TMA тримеллитовый ангид рид; PMA пиромеллитовый ангидрид; GA глюкозамина гидрохлорид; CA цитраконовый ангидрид; MA малеино вый ангидрид; AQ антрахинон-2-карбоновая кислота; ДМФА диметилформамид; ТГФ тетрагидрофуран; АЦН аце то нитрил; ДМСО диметилсульфоксид; ТМБ 3,3,5,5 -тетраметилбензидин; Ф фенол; АФ 4-аминофенол; МФ 4-ме тилфенол; НФ 4-нитрофенол; н.д. нет данных.
13 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 49 соответствии с табл. 1) при 65 о С была в 4 раза меньше по срав не нию с нативным ферментом [77]. EG-NHS-HRP и SA-NHS-HRP также были более устойчивы в диметилформамиде (ДМФА), мета ноле, тет ра гидрофуране (ТГФ), а каталитическая активность модифи циро ванных ферментов оставалась на уровне нативной HRP. Модификация HRP монофункциональными реагентами также дала положительные результаты. AA-NHS-HRP была в 5 раз более стабильна при 65 о С и значительно более активна в органических растворителях (метаноле, ДМФА и ТГФ), чем n-hrp [75]. Модификация фталевым ангидридом (PA) [78 80], гидрохлоридом глюкозамина (GA) [78] и антрахинон-2-карбоновой кислотой (AQ) [81, 84] позволила получить не только более стабильные, но и более каталитически эффективные (высо кое значение k cat /K m ) ферменты в реакциях окисления фенола и его производных (4-амино-, 4-метил- и 4-нитрофенола). Модификация AQ привела к улучшению как каталитической константы k cat, так и константы Михаэлиса K m фермента к фенолу. Кроме того, AQ успешно выполняла роль медиатора электронного переноса между перок сидазой и электродом, увеличивая общую эффективность процесса. Каталитическая активность PA-HRP была изучена как в водном растворе, так и в присутствии ДМФА. В водном растворе в отно шении всех перечисленных субстратов PA-HRP демонстрировала более высокую каталитическую активность (k cat ) и более низкое значение K m по сравнению с n-hrp. В растворе ДМФА величины K m для модифицированного фермента (за исключением 4-нит ро фе нола) были лучше, однако каталитическая константа была немного ниже. Тем не менее, во всех случаях эффективность PA-HRP (k cat /K m ) была выше, чем у n-hrp. Термостабильность PA-HRP также зна чи тельно повы силась: после инкубации в течение 90 минут при 50 о С фермент сохра нял около 80% активности. По отношению к n-hrp время полужизни τ 1/2 модифицированного фермента при 50 о С увели чи лось в 10 раз (при 65 о С в 4 раза). Возросла и устойчивость к орга ническим раст ворителям (метанолу, диметилформамиду, ацето нит рилу, тетрагид рофурану). Аналогичное повышение стабильности было достигнуто и для фер ментов, модифицированных цитраконовым и малеиновым ангидри дами (CA-HRP и MA-HRP соответственно) [82, 83]. При комнатной температуре возросла их стабильность в диметилсульфоксиде (ДМСО), ТГФ и ДМФА. Время полужизни полученных ферментов при 70 о С увеличилось примерно в 3 раза, а активность после инкубации в течение 3 часов при 50 о С составляла 82, 74 и 30% от исходной для MA-HRP, CA-HRP и n-hrp соответственно. Для TMA-HRP и
14 50 Г.С.Захарова и соавт. PMA-HRP существенных изменений в термостабильности не наблюдали, поэтому дальнейшее изучение их свойств не проводили [79]. Таким образом, можно выделить два различных подхода к химической модификации поверхности HRP с использованием бифунк циональных и монофункциональных реагентов. В первом случае происходит образование внутримолекулярных сшивок. Установлено, что на одну молекулу фермента приходится лишь одна сшивка в проксимальном домене (между Lys232 и Lys241), при этом оста ток Lys174 также подвергается модификации. Эти результаты согла суются с полученными ранее данными [77] о доступности для моди фикации аминогрупп остатков лизина и их взаимном располо жении, определяющем возможность образования между ними сшивки при использовании бифункциональных агентов известной длины. Вероятно, в этом случае стабилизирующий эффект связан с уве ли чением «жесткости» молекулы в области проксимального кальций-связывающего домена, что может препятствовать диссоциации иона кальция, имеющего важное структурное значение [77]. Работы по модификации HRP монофункциональными реагентами в свою очередь можно разделить на приводящие к 1) нейтрализации поло жительного заряда остатков Lys (например, ацетилирование фермента с помощью AA-NHS [74]); 2) смене положительного заряда остатков Lys на отрицательный (например, модификация фта левым альдегидом [78 80]). Отдельно стоит выделить реагенты, выступаю щие в качестве медиаторов переноса электронов (например, антрахинон-2-карбоновую кислоту [81, 84]), так как в этом случае основ ной целью модификации является не повышение стабильности фермента, а увеличение эффективности переноса электронов между HRP и электродом. С точки зрения повышения стабильности фермента, наиболее сильный эффект наблюдался при введении с заместителем одного отрицательного заряда на один модифицированный остаток Lys. При модификации фермента TMA и PMA количество вводимых отри цательных зарядов на один остаток лизина возрастало до двух и трёх соответственно, но стабилизирующий эффект при этом не наблю дался. Как полагает ряд авторов, изменения в характере электро ста тических взаимодействий в молекуле фермента могут при во дить к его стабилизации [77, 79, 83]. Таким образом, путём химических модификаций остатков лизина можно добиться существенных улучшений свойств перокси дазы хрена. Однако и мутагенез, и химическая модификация ами но кислотных остатков затрагивают лишь белковую часть фер мента. Альтернативным подходом является внесение изменений в просте тическую группу — гем.
15 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 51 V. ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ПРОСТЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ Гем в глобуле пероксидазы связан нековалетно, и давно существуют хорошо отработанные методики как его удаления для получения апофермента, так и реконструкции холо-формы HPR из апо-фермента и гема [85, 86]. Последний способ активно используется при рефолдинге рекомбинантной HPR из телец включения [57]. Те же методики были использованы и для изучения влияния модификации порфирина на свойства пероксидазы. В области исследования химической модификации гема можно выделить два основных направления: 1) исследование механизма воз никновения модификаций протопорфирина в результате его взаимо действия с образующимися в ходе реакции радикалами (автока талитическая модификация) и влияние этих модификаций на свойства фермента, и 2) направленная химическая модификация гема с целью изучения свойств HPR с измененным протопорфирином. На рис. 1 приведена структура гема и варианты его модификации, изучен ные различными авторами. Нумерация представленных производных протопорфирина будет использоваться далее для сокращения названий комплексов апо-белка с соответствующим моди фици рованным гемом. Представленные на рис. 1 соединения 1 5 образуются в результате автокаталитической модификации гема [87 91] и, в основном, являются его δ-мезо-производными (δ-атом углерода по номенклатуре Фишера соответствует С 20 по номенклатуре ИЮПАК). Введение заместителей в это положение, как правило, сопровождается необратимой потерей активности фермента. Исключением является реакция с метилгидразином (МГ): после очистки с помощью гель-фильтрации фермента, содержащего δ-мезо-метилгем в качестве простетической группы (соединение 2c, рис. 1), от субстратов и продуктов реакции наблюдалось медленное восстановление каталитической активности, однако степень реактивации фермента не была указана [88]. При модификации гема радикалы, образующиеся в процессе катализа, должны взаимодействовать и с белковой глобулой, что также может служить причиной инактивации HRP. Возникновение хими чес ких модификаций в полипептидной цепи было подтверждено экспе ри ментально путём введения радиоактивных меток в соответ ст вующие субстраты. Оказалось, что в зависимости от типа субст рата соотношение доли модификации в протопорфирине и в белко вой глобуле сильно варьирует. Например, при использовании в качестве субстрата фенилгидразина (ФГ) атаке радикалов в
17 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 53 деструкция интактного гема. Поэтому для достижения максимального выхода модифицированного гема реакцию проводили в присутствии высоких концентраций ацетата при минимальном времени проведения процесса. При замене ацетата на н-гексановую или фенилуксусную кис лоту были получены идентичные результаты. Инкубация же в цит ратном буфере не приводила к образованию модифицированного прото порфирина [91]. Таким образом, модификация гема наблюдалась только в случае алкилкарбоновых кислот. Важной характеристикой гемсодержащих белков служит присутствие в спектре поглощения полосы с максимумом около 403 нм (полоса Соре). Изменения в интенсивности и положении максимума полосы Соре отражают изменения в структуре фермента в области активного центра [92]. Во всех упомянутых выше случаях автокаталитической модификации гема (за исключением ацетилирования) потеря активности сопровождалась заметным снижением интенсивности полосы Соре и сдвигом максимума в длинноволновую область. Эксперименты, аналогичные описанным выше, проводились и с другими гем-содержащими ферментами и белками. Например, реакция с фенилгидразином приводила к инактивации цитохрома P-450 [93], миоглобина [94] и каталазы [95, 96]. Для последней также наблюдали инактивацию в присутствии азид-иона. Однако химической модификации гема в этих случаях не происходило. Вместо этого в реакцию с радикалами вступал атом железа, и причи ной ингибирования фермента являлось образование прочного шести коор динационного комплекса, что препятствовало его взаимодействию с Н 2 О 2. Оценка величины площади поверхности, доступной для раствори теля (ППДР), показывает, что практически весь гем в HRP экранирован от растворителя белковой глобулой, за исключением области С 18 С 20 атомов (для С 18 ППДР составляет 3,2 Å 2 ; для С 20 2,4 Å 2 ). Это говорит о «закрытости» активного центра пероксидазы хрена для про никновения относительно больших молекул и, следовательно, о невоз можности их взаимодействия с атомом железа. Таким образом, из приведенных выше данных по автокаталитической модификации можно сделать следующие выводы: 1) гем в HRP расположен в узкой полости, исключающей возможность проник новения даже относительно небольших молекул; 2) атаке радикалами и, как следствие, модификации подвергается единственный относительно открытый участок протопорфирина (δ-кромка гема); 3) этот процесс приводит к потере ферментативной активности.
18 54 Г.С.Захарова и соавт. Перейдём к рассмотрению второй группы модифицированных по гему ферментов, получаемых путём встраивания синтетических производных гема (СПГ) в апо-белок. Их структуры представлены на рис. 1 (соединения 6 9). Все указанные СПГ были получены посредством химической модификации пропионовых групп гема и различаются лишь природой заместителей. Для получения реконструированных HRP (rs-hrp) применялась стандартная методика (с небольшими изменениями, например, с увеличением времени инку бации) [97, 102]. При внесении СПГ в раствор апобелка за счет их встраивания в белковую глобулу происходило восстановление катали тической активности фермента. Добавление к раствору rs-hrp немоди фицированного гема не приводило к дальнейшему увеличе нию ферментативной активности, что может служить подтвержде нием полноты встраивания СПГ в полость фермента, а сходство спектров поглощения для rs-hrp и n-hrp подтверждением специфичности процесса. Введение заместителей в гем приводило к изменению как струк туры белковой глобулы, так и в свойств фермента в сравнении с натив ной HRP. В большинстве случаев происходила компактизация молекулы (за исключением 6-rs-HRP, в этом случае существенных изменений не наблюдалось; см. табл. 2; в таблице и далее в тексте в обозначении HRP с модифицированным гемом цифра соответствует номеру структуры гема на рис. 1). Более плотной упаковкой можно объяснить тот факт, что термостабильность 8- и 9-rs-HRP была выше, чем у n-hrp время полужизни τ 1/2 увеличилось в 2 4 раза [97, 98]. Помимо повы ше ния термостабильности в некоторых случаях произошло увели чение и стабильности фермента в органических растворителях. Устой чивость 8a-rs-HRP к ацетонитрилу, диметилсульфоксиду и метанолу значительно превосходила устойчивость n-hrp (8b-rs-HRP также была более устойчива, но в меньшей степени). Структуры 9a-, 9b- и 9c-rs-HRP были более стабильны в растворе диметилформамида (ДМФА) при 60 о С [98]. Введение заместителей в гем приводило также и к изменению спектральных характеристик ферментов. Флуоресценция белков обус ловлена остатками Trp, Tyr и Phe. В молекуле HRP присутствует один остаток триптофана (Trp117), 5 остатков тирозина а также 20 остатков фенилаланина [19]. При длине волны возбуждения 295 нм флуорес ценция триптофана преобладает в суммарном спектре флуо ресценции фермента [99]. Максимум излучения флуо рес ценции остатка Trp в n-hrp находится на 328 нм. Спектр флуо рес ценции HRP зависит от миграции энергии воз буж дения Trp117 на гем. Следова тельно, изменения структуры фермента в области связывания
20 56 Г.С.Захарова и соавт. фоб ных взаимодействий между ароматическими субстратами и бензольным кольцом заместителя в положении R 2 (рис. 1). Синтетические производные гема (СПГ), образующиеся в результате этерификации пара-производных фенола с карбоксильными группами гема, оказывали различное влияние на каталитические свойства фермента. Активность и сродство 9а-rs-HRP по отношению к фенолу возросли, в то время как 9b- и 9c-rs-HRP демонстрировали ухудшение каталитических свойств. Такое изменение свойств связывают с различиями в донорно-акцепторных свойствах заместителей: акцепторы электронов (п-нитрофенол) снижают электронную плот ность порфиринового кольца, таким образом повышая скорость вос ста новления Соединения II до нативного фермента [98]. Таким образом, из экспериментов по получению реконструированной пероксидазы хрена с модифицированным гемом можно сделать следующие выводы: 1) встраивание СПГ в апобелок протекает достаточно эффективно даже при использовании для моди фика ции пропионовых групп объёмных заместителей; 2) полученные реконструированные ферменты в большей или меньшей степени сохраняют каталитическую активность (в отношении некоторых субстратов активность rs-hrp может заметно превосходить активность n-hrp); 3) на каталитические свойства HRP можно влиять путём варьи рования вводимых в гем заместителей. VI. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ HRP С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ГЕМА Для понимания механизма и объяснения эффектов изменения свойств пероксидазы с модицифинованными производными гема нами было проведено компьютерное моделирование пространственных структур комплексов апо-фермент модифицированный гем. Наиболее интересные, как нам представляется, результаты представлены ниже. Построение моделей производилось с помощью модуля Builder програм много комплекса InsightII (Accelrys Inc., SanDiego, CA, USA). В качестве начальной выступала структура пероксидазы хрена (PDB код 1ATJ). С использованием инструментов Builder к гему достраивались допол нительные химические группы. Далее проводился визуальный анализ модели для выявления тесных контактов между атомами введён ных заместителей и окружающих аминокислотных остатков. Если такие имелись, то варьированием торсионных углов боковой цепи амино кислотных остатков атомы раздвигались друг от друга на прием лемое расстояние (данная процедура имела место в отноше нии
21 Пероксидаза из корней хрена: модулирование свойств 57 остатка Pro141 в случае 1а- и 2а-HRP и остатка Arg31 в случае 9a-, 9b- и 9c-rs-HRP). После этого структура подвергалась 500 шагам энергетической минимизации с применением программы Discover_3 пакета InsightII с целью приведения белковой структуры к рав но весию. Использование энергетической минимизации оправдано, когда начальное возмущение структуры может быть устранено за счёт неболь ших смещений атомов в локальной области белковой молекулы. В ряде случаев такие возмущения оказались весьма существенны или вообще неустранимы энергетической минимизацией. К примеру, в случае фермента 1a-HRP бензольное кольцо в положении R 1 пересекается с остатком Pro141, образуя неустранимый дефект. Для его устранения было проведено поэтапное моделирование: сначала в положение R 1 вводилась метильная группа, после чего структура подвергалась минимизации; затем метильная группа удалялась, а вместо неё вставлялось бензольное кольцо. В полученной структуре имелись тесные контакты между атомами бензольного кольца и бел ковой глобулой, но они не препятствовали проведению энергети ческой минимизации. Следующим этапом стало применение метода молекулярной динамики, как более эффективной процедуры приведения белковых структур к равновесию. Был применён стандартный протокол молекулярной динамики при постоянной темпера туре (T = 300 K) в вакууме (два катиона кальция и молекулы связан ной воды, присутствующие в кристаллической структуре, были включены в систему). Шаг интегрирования составлял 1 фс, длина траектории 20 пс. Для всех расчётов использовалось силовое поле CVFF [103]. Во всех случаях наибольшие структурные изменения проис ходили в первые 5 пс что свидетельствует о стабильности полу ченных структур. На рис. 2 представлены результаты моделирования 1а HRP. Исходная структура представлена более светлым цветом, а модельная более темным. Как видно из рис. 2, наибольшие структурные изме нения произошли в районе аминокислотных остатков Введе ние бензольного заместителя в гем приводит к тому, что эта группа оказывается в том месте, где в нативном ферменте располо жен остаток Pro141. Для снятия стерических затруднений в струк туре модифицированного фермента произошел небольшой пово рот порфиринового кольца относительно оси Fe His170 и общее «заглубление» гема в занимаемой полости. Изменения также затро нули остатки Phe68 и Phe142, участвующие в связывании арома тических субстратов, и каталитические остатки His42 и Arg38, играющие ключевую роль в расщеплении пероксида водорода.
22 58 Г.С.Захарова и соавт. Рис. 2. Сравнение структур пероксидаз, содержащих нативный и модифицированный гем (соединение 1a на рис. 1) (ука заны светлыми и темными цветами, соот ветственно). Рис. 3. Сравнение структур пероксидаз, содержащих нативный и модифицирован ный гем (соединение 2a на рис. 1) (указаны светлыми и темными цветами, соответственно). Согласно экспериментальным данным, 1а HRP реагировала с H 2 О 2 с образованием Соединения I, но не восстанавливалась до Соединения II при добавлении электрон донорного субстрата. Полу ченная компьютерная модель хорошо согласуется с высказанным ранее предположением [87], что отсутствие каталитической актив ности 1а HRP по отношению к гваяколу может быть объяснено воз никно ве нием стерических препятствий для контакта субстрата с гемом. Воз можно, определённую роль играют и изменения в положении остат ков Phe142 и Phe68. В случае 2а HRP (рис. 3), где бензольное кольцо не столь «жёстко» связано с протопорфирином, смещение остатков менее выра жено. Кроме того, тесного контакта введённого заместителя с Phe141 удаётся избежать без сдвига гема. В остальном картина схожа с преды дущим случаем, и причиной потери активности фермента, вероятно, также состоит в том, что объёмный заместитель в δ мезо поло жении блокирует для субстратов доступ к активному центру. Структура комплекса диметилового эфира протопорфирина с апо белоком (6 rs HRP), полученная с помощью компьютерного моделирования, практически совпадает со структурой рекомбинатного фермента (на рис. не показано). Однако данные спектроскопического анализа говорят о структурных изменениях в гем связывающей области: наблюдался сдвиг максимума пика Соре реконструирован-
20 56 Г.С.Захарова и соавт. фоб ных взаимодействий между ароматическими субстратами и бензольным кольцом заместителя в положении R 2 (рис. 1). Синтетические производные гема (СПГ), образующиеся в результате этерификации пара-производных фенола с карбоксильными группами гема, оказывали различное влияние на каталитические свойства фермента. Активность и сродство 9а-rs-HRP по отношению к фенолу возросли, в то время как 9b- и 9c-rs-HRP демонстрировали ухудшение каталитических свойств. Такое изменение свойств связывают с различиями в донорно-акцепторных свойствах заместителей: акцепторы электронов (п-нитрофенол) снижают электронную плот ность порфиринового кольца, таким образом повышая скорость вос ста новления Соединения II до нативного фермента [98]. Таким образом, из экспериментов по получению реконструированной пероксидазы хрена с модифицированным гемом можно сделать следующие выводы: 1) встраивание СПГ в апобелок протекает достаточно эффективно даже при использовании для моди фика ции пропионовых групп объёмных заместителей; 2) полученные реконструированные ферменты в большей или меньшей степени сохраняют каталитическую активность (в отношении некоторых субстратов активность rs-hrp может заметно превосходить активность n-hrp); 3) на каталитические свойства HRP можно влиять путём варьи рования вводимых в гем заместителей. VI. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ HRP С МОДИФИЦИРОВАННЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ ГЕМА Для понимания механизма и объяснения эффектов изменения свойств пероксидазы с модицифинованными производными гема нами было проведено компьютерное моделирование пространственных структур комплексов апо-фермент модифицированный гем. Наиболее интересные, как нам представляется, результаты представлены ниже. Построение моделей производилось с помощью модуля Builder програм много комплекса InsightII (Accelrys Inc., SanDiego, CA, USA). В качестве начальной выступала структура пероксидазы хрена (PDB код 1ATJ). С использованием инструментов Builder к гему достраивались допол нительные химические группы. Далее проводился визуальный анализ модели для выявления тесных контактов между атомами введён ных заместителей и окружающих аминокислотных остатков. Если такие имелись, то варьированием торсионных углов боковой цепи амино кислотных остатков атомы раздвигались друг от друга на прием лемое расстояние (данная процедура имела место в отноше нии
ПЕРОКСИДАЗЫ , peroxydasae, arum, f, pi.—единое название группы ферментов класса оксиредуктаз, которые катализируют в живых клетках реакции окисления различных веществ с помощью H2O2.
Самыми изученными считаются пероксидазы из корней хрена, чьи молекулы состоят из одной полипептидной цепи связанной ковалентно с 8 олигосахаридными цепями и простетической группой, которая близка гемму гемоглобина. При этом гемм гемоглобина не характеризуется сильной пероксидазной активностью.
Пероксидазы существуют в виде нескольких форм, а именно изоферментов. Их процентное соотношение и состав напрямую зависит от самого растения.
Пероксидазы широко распространились не только в животных, но и в растительных клетках, а значит, могут находиться в цитоплазме, а также в связанном состоянии с клеточной стенкой.
Помимо этого пероксидазы участвуют в фотосинтезе, энергетическом обмене, в трансформации пероксидов и в-в, чужеродных организму. Активность пероксидаз и изоферментный состав подвергаются значительному изменению во время стрессовых состояний, ранениях, вирусных и микробных инфицированиях организма.
Перкосидазы также применяются с аналитической целью, например для того чтобы определить микро количество H2O2, ароматические амины, загрязнения в окружающей среде, а также с целью проведения иммуноферментного анализа.
Пероксидазная активность учитывается непосредственно во время селекции растений, так например чем она выше, тем устойчивее растения к инфекции. В будущем планируют использовать пероксидазу для селективного окисления органических соединений, а также с целью проведения глубокой очистки сточной воды от ароматических соединений.
Пероскидазы являются катализаторами окисления различных полифенолов, алифатических и ароматических аминов, а также жирных кислот, цитохромов, глутатионов и т.д.
Пероксидазы, которые выделяются из различных источников, отличаются по молекулярной массе и субстратной специфичности. Помимо этого они выполняют важную роль в дыхании растений, так как катализируют вместе с полифенолоксидазой окисление дыхательных хромогенов в дыхательные пигменты. У млекопитающих пероксидазы встречаются только в молоке и лейкоцитах.
Пероксидазы хрена широко применяются в лабораториях для выявления глюкозы в крови и моче, а также в качестве маркерного белка в цитохимических исследованиях.
Пероскидазы являются катализаторами окисления различных полифенолов, алифатических и ароматических аминов, а также жирных кислот, цитохромов, глутатионов и т.д.
Давайте будем совместно делать уникальный материал еще лучше, и после его прочтения, просим Вас сделать репост в удобную для Вас соц. сеть.
26 Сен 2021 foodhranenie 148